Mimo trwania II wojny światowej Wileńskie Seminarium Duchowne w jesieni 1939 r. wznowiło swoją działalność. Nie wszyscy klerycy mogli przyjechać, zwłaszcza z południowych i zachodnich stron Polski. Po rozpoczęciu zajęć w Seminarium w dniu 20 września, klerycy nadal zjeżdżali się i ostatecznie zebrało się 95 alumnów. Po likwidacji przez władze litewskie Uniwersytetu Stefana Batorego, w ramach Seminarium działał dalej potajemnie Wydział Teologiczny. Seminarium działało w bardzo trudnych warunkach, które bardzo się pogorszyły po zajęciu Litwy przez Związek Radziecki. Nowe władze usiłowały szybko zamknąć tę uczelnię. W sierpniu 1940 r. trzy czwarte gmachu seminaryjnego zajęły instytucje sądowe. W następnym miesiącu kazano opuścić pozostałą cześć gmachu. Likwidacji seminarium zapobiegły wówczas odwołania władz seminaryjnych do Komisariatu Spraw Wewnętrznych w Kownie i przetrwało ono do końca okupacji sowieckiej.
        Pod okupacją niemiecką seminarium w jesieni 1941 r. zaczęło kolejny rok akademicki. Bardzo liczny był rok I, gdyż liczył aż 32 alumnów. Razem na wszystkich latach było ponad 90 kleryków, w tym kilkunastu z innych diecezji i zakonów. 3 III 1942 r. Seminarium otoczyło gestapo i policja litewska. Profesorów i alumnów aresztowano i umieszczono w więzieniu na Łukiszkach. Uwięziono następujących księży profesorów: Antoniego Cichońskiego, Jana Ellerta, Czesława Falkowskiego (byłego rektora USB), Michała Klepacza (dziekana Wydziału Teologicznego), Antoniego Korcika, Józefa Marcinkowskiego, Pawła Nowickiego, Antoniego Pawłowskiego, Leona Puciatę, Leonarda Pukiańca, Władysława Suszyńskiego, Walentego Urmanowicza i Jana Uszyłłę (rektora Seminarium) oraz prokuratora ks. Jana Krassowskiego i pomagającego mu w zbieraniu produktów na utrzymanie profesorów i kleryków - ks. Antoniego Bachurzewskiego. 18 III 1942 r. 11 profesorów wywieziono do Wiłkowyszek i tam internowano w gmachu Wyższego Seminarium Duchownego. Trzej profesorowie: Ellert, Nowicki i Pawłowski przebywali w więzieniu do 7 lipca i wówczas dołączono ich do księży znajdujących się w Wiłkowyszkach. Torturom był poddawany w więzieniu prokurator Seminarium ks. Krassowski. W ten sposób zmuszono go do wydania kosztowności seminaryjnych. 17 X 1942 r. księża profesorowie zostali wywiezieni do obozu pracy w Szałtupiu koło Kowna. Niektórzy z nich przeszli potem przez więzienia oraz obozy pracy w Poniewieżyku i Prowieniszkach. W końcu marca 1943 r. ze względu na stan zdrowia zwolniono księży: Puciatę, Suszyńskiego i Uszyłłę, a we wrześniu i październiku tego roku profesorów: Falkowskiego, Nowickiego i Urmanowicza. Inni przebywali w obozie do wyzwolenia przez Armię Czerwoną 16 VII 1944 r. i wrócili do Wilna. Ks. Puciata, który wrócił z obozu ciężko chory, zmarł po kilku miesiącach (12 VII 1943 r.) i pochowany został na cmentarzu bernardyńskim. Przejścia więzienne i obozowe bardzo skróciły jego życie.
        Trzeba zaznaczyć, że księża profesorowie: Władysław Rusznicki, Michał Sopoćko i Ignacy Świrski uniknęli aresztowania i do końca okupacji musieli ukrywać się poza Wilnem.
        Z uwięzionych ponad 80 alumnów po kilku dniach zwolniono kleryków narodowości litewskiej (6 III). Innych po dwumiesięcznym pobycie w więzieniu wywieziono dnia 5 V 1942 r. na roboty do Niemiec. Część alumnów uciekła z transportu już w Wilnie, niektórzy w Grodnie, Białymstoku i w Warszawie. Wśród tych, którzy uciekli z wagonu w Warszawie był diakon Edward Kisiel, który w tym mieście w następnym roku przyjął święcenia kapłańskie. Do Niemiec dojechało 31 kleryków. Niektórzy z nich przeszli tam jeszcze przez więzienia, a dwóch: Wojciech Grzegorzek i Piotr Skraga, przeszło przez obozy w Buchenwaldzie i Dachau.
        Na szczególne odnotowanie zasługują losy alumnów, którzy zachorowali w więzieniu i znaleźli się w szpitalu. Diakon Augustyn Piórko, alumn warszawskiego seminarium, ale pochodzący z Kalwarii Wileńskiej, zachorował na zapalenie opon mózgowych i zmarł 13 IV 1942 r. Do choroby przyczyniły się ciężkie warunki więzienne. Innych 7 chorych kleryków zwolniono. Trzej z nich w niedługim czasie złożyli ofiarę ze swego życia. Henryk Żyźniewski, przebywając na plebanii, został aresztowany razem z proboszczem i rozstrzelany pod Mińskiem w końcu 1942 lub na początku 1943 r. Anastazy Wasilewski został później wywieziony na roboty do Kowna i tam zmarł w 1942 lub 1943 r. Natomiast Józef Sokołowski, alumn V roku, zginął w wypadku samochodowym koło Mejszagoły w końcu lutego lub na początku marca 1943 r. Inny alumn, zwolniony z więzienia, Leon Piotrowski, przebywał u krewnych w parafii Mejszagoła. W związku z załatwianiem formalności pogrzebowych swego kolegi został aresztowany i umieszczony znowu w więzieniu na Łukiszkach, a stąd wywieziono go do obozu ciężkich prac w Prowieniszkach, gdzie ze swoimi niektórymi profesorami dzielił ciężki los więźnia aż do wyzwolenia.
        Franciszek Ogonowski, alumn I roku, uniknął wywózki do Niemiec, ale w sierpniu 1942 r. został aresztowany przez gestapo i w 1943 r. został rozstrzelany w Wilnie. Natomiast Feliks Kochanowski, pochodzący z parafii Krynki, który uciekł w Grodnie z transportu, przebywał później na plebanii w Jałówce u ks. Edmunda Roszaka. 13 VII 1943 r. został on rozstrzelany koło Świsłoczy razem z grupą zakładników, wśród których był wspomniany ks. Roszak, jezuita, ks. kanonik Marek Burak, proboszcz Mścibowa i ks. dr Józef Kozłowski, były profesor Seminarium Duchownego w Pińsku.
        Trzeba też zaznaczyć, że alumn Seminarium Wileńskiego Stefan Wenta, pochodzący z Pomorza, który nie mógł kontynuować nauki, został w 1940 r. aresztowany i w 1943 r. rozstrzelany przez Niemców w Tucholi. Jeszcze inny był los alumna Lucjana Kosińskiego z parafii Turośń Kościelna. Uciekł on z transportu w Białymstoku i całą wojnę przebywał w Izbiszczach w parafii Śliwno, gdzie zaangażowany był w potajemne nauczanie, m.in. grupy AK-owców. Gdy przyszli sowieci, NKWD aresztowało go 19 IX 1944 r. Następnie został uwięziony w Białymstoku, a 7 XI 1944 r. wywieziony do obozu w Ostaszkowie, a stąd do obozu w Riazaniu. W styczniu 1946 r. wrócił do Polski i wkrótce zgłosił się do Wileńskiego Seminarium, działającego już w Białymstoku.
        Profesorowie i alumni Wileńskiego Seminarium Duchownego dali swój wkład cierpień w tym strasznym okresie II wojny światowej. Prawie wszyscy przeszli przez więzienia i obozy. 7 alumnów zginęło w czasie wojny, a księdzu prof. L. Puciato więzienie i obóz przyśpieszyły śmierć. Poniewierka i cierpienia były udziałem wszystkich, a dla szeregu alumnów wojenne czasy przeszkodziły w dojściu do kapłaństwa.